大鼠的血管内皮细胞生长因子ELISA试剂盒

预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液

体中肿瘤特异生长因子（TSGF）含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中TSGF水平。

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依

次加入TSGF、生物素化的抗人TSGF抗体、HRP标记的亲和素,经过

*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝

色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的

TSGF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）,计算

样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1.酶联板:一块（96孔）
2.标准品（冻干品）:2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖

好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为

10000pg/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释成为

10000pg/ml,5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/

ml,156 pg/ml,其原液直接作为zui高标准浓度,样品稀释液直接作

为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。
如配制5000pg/ml标准品:取0.5ml,10000pg/ml的上述标准品加入

含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此

类推。
3.样品稀释液:1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A:1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B:1×10ml/瓶。
6.检测溶液A:1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100

稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制
（每孔100ul）,实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A

加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配

制。
7.检测溶液B:1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1：100

稀释。稀释方法同检测溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.终止液:1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
标本的采集及保存
1细胞培养物上清:请离心后收集上清,并将标本保存于-20℃,且

应避免反复冻融。
2.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分

钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融

。
3.血浆;可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 -

8℃ 1000xg离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复

冻融。
注;标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项

检测。
操作步骤
各试剂在使用前平衡至室温。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余

孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混

匀,酶标板加上盖，37℃反应120分钟。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。
3.每孔加检测溶液A工作液 100ul,37℃,60分钟。洗板次,350ul/

每孔,甩干。
4.每孔加检测溶液B工作液100ul,37℃,60分钟,洗板5次,甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见

标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显）。
6.依序每孔加终止溶液50ul,终止反应（此时兰色立转黄色）。用

酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
注：
1.每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是zui后

加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在

实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗

涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过

程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过

程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人TSGF,且与其它相关蛋白无

交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标）,OD值为纵坐标（普通坐标）,

在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查

出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出

标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式，计算出

样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2.一次加样时间控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排

枪加样。
3.请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。
4.如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请zui后

乘以稀释倍数。
5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制，

不能混淆。
6.底物请避光保存。
检测范围:156pg/ml-10000pg/ml
说明
1.试剂盒保存:-20℃（较长时间不用时）;2-8℃（频繁使用时）。
2.有效期:6个月
3.浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象

，不会对实验结果造成任何影响。
5.中、英文说明书可能会有不*之处,请以英文说明书为准。