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详细介绍
| 银染法端粒酶活性检测试剂盒 型号:NKJ15DLM | 货号: |
| 一、原理 端粒DNA与细胞的寿命密切相关，而合成又依赖于端粒酶。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达，而肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常的高表达。因此对组织或细胞中端粒酶活性的检测具有重要意义。TRAP－银染法端粒酶活性检测试剂盒是采用端粒重复序列扩增的方法，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带，条带的深浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，同时缩短了检测所需的时间，避免了同位素的放射污染。 三、操作步骤 1． 细胞端粒酶和组织标本端粒酶的提取 （1） 用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~2×106细胞；若是组织标本，称取0.5g左右的组织，用PBS洗涤后，研碎； （2） 加入1ml冰冷的Wash buffer(使用前每ml Wash buffer中加入1μL 1M的DTT)，悬浮上述样品，置冰上5min； （3） 4oC，离心 (3,000 rpm，5min)，弃上清； （4） 加入40μL冰冷的Lysis buffer [使用前每ml Lysis buffer中加入0.5μL PMSF（100mM溶于异丙醇）和0.5μLβ-巯基乙醇（0.5M溶于水，一般市售纯液体为14.3M）]，悬浮沉淀，涡旋振荡10s，置冰上30min，其中间隔数分钟，涡旋振荡一次，共3-5次； （5） 4oC，离心 (13,000 rpm，30min)； （6） 把离心上清转移至新的管中，放置冰上并测定其蛋白浓度，zui后用Lysis buffer调浓度至5～10μg/μL，于－20℃保存备用； 2． PCR扩增 （1） 吸取5μL 10×TRAP buffer，另加入1μL dNTPs，1μL Taq-DNA polymerase， 1 μL TS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入39μL灭菌超纯水，于PCR扩增仪上23 oC保温10min； （2） 加入1μL CX primer，混匀，在扩增仪上进行27个循环，循环参数94 oC，30s；50 oC，30s；72 oC，90s；zui后72 oC延伸5min； 以下步骤的试剂需用户自备。 3． 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1） 制备12％非变性聚丙烯酰胺凝胶（10ml） 30％Acr－Bis（29：1） 4 ml H2O 4.92 ml 10×TBE 1 ml 10％APS 70 μL TEMED 10 μL （2） 在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑1hr； （3） 取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1hr； 4． 银染 （1） 将凝胶置10％乙酸固定30min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次5min； （2） 将凝胶置于0.2 g/L*浸泡1min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次30s； （3） 将凝胶置于*染液浸泡30min，然后用蒸馏水漂洗15s； （4） 将凝胶置于显色液中显色10min左右直到全部条带显色为止； （5） zui后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。 四、储存 dNTPs、Taq-DNA polymerase、TS primer、CX primer－20 oC保存，其它试剂4 oC保存。 保质期：一年。 用户自备试剂配方： 10×TBE（pH=8.3） (100mL) 10×上样缓冲液(10mL) 10.8g Tris 25mg 溴酚兰 5.5g 硼酸 4g 蔗糖 4ml 0.5M EDTA 定容至10mL 定容至100mL *染液(100mL) 显色液(100mL) 0.2g * 3g 碳酸钠 25μL 37％甲醛 25μL 37％甲醛 定容至100mL 0.4mg * 定容至100mL | 产品图片 |
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