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解说分光光度计的蛋白质定量

阅读:229发布时间:2014-10-17

分光光度计已经成为现代生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白质定量等,其采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

  比色法蛋白质定量

  蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如*,*)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。

  比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等几种方法。

  Lowry 法:以zui早期的Biuret 反应为基础,并有所改进。蛋白质与Cu2 反应,产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比,Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

  BCA法:这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ,后者与BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系*,反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法,操作简单,敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

  Bradford 法:这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特点是,敏感度好,是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍;操作更简单,速度更快;只需要一种反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;而且与一系列干扰Lowry,BCA 反应的还原剂相容。但是对于去污剂依然是敏感的。zui主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。

 蛋白质的直接定量

  这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320nm 的“背景"信息,设定此功能“开"。与测试核酸类似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,*的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时,发现读数“漂移"。这是一个正常的现象。事实上,只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度,乘以一定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。



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