实验室阶段种子制备流程

在发酵生产中，各个生产环节环环相扣，任何个环节达不到生产工艺的要求，都会造成不可逆转的巨大损失，而种子扩大培养又当其冲，因此必须高度重视种子扩大培养这环节。不同种子的扩大培养工艺流程总体相似，但是具体的控制条件（如温度、培养时间等）都因种子不同而有些差别，这些差别往往是种子扩大培养成功与否的关键。因此，在扩大培养特定的种子时，在遵循种子扩大培养的般原则和般流程的基础上，应根据种子特性和生产要求做适当调整，也可以进行试验，优化种子扩大培养工艺。

细菌、酵母菌、霉菌和放线菌的生理特性显著不同，种子扩大培养工艺流程差别也较大。实验室种子的制备般采用两种方式：①对于产泡子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的种子（如霉菌等），可以采用固体培养基培养孢子，孢子直接作为种子罐的种子。这种方法操作简便，不易污染杂菌。②对于细菌、酵母菌或产孢子能力不强、孢子发芽慢的种子（如链霉菌），采用液体摇瓶培养。

（1）细菌实验室扩大培养

原种般保存在冷冻管内，些产芽孢的细菌（如芽孢杆菌等）可用斜面或沙土管保存。其扩大培养工艺为（包括生产车间种子制备）：冷冻管或斜面斜面斜面（二代以上）种子罐发酵罐细菌培养的适温度般为37℃（近年来对海洋微生物的研究表明，有许多菌株为低温菌株，适生长温度在15℃左右），培养时间因菌种而异，达到对数生长期般要20h左右，有的芽孢需5~6d，甚至20d以上。

细菌种子的培养基般采用碳氮比较小的培养基，氮源供应要相对丰富些。如牛肉膏、蛋白胨、酵母育、马丁肉汤等，因为有充足的氮源供应，可以大限度地复苏菌种活力或使菌体的增殖速率达到大。

制备细菌斜面时，先在冷冻管加入适量无菌水（加入无菌水使菌体均匀分布在水中，便于转接；同时保证同支菌种转接的不同斜面相对较均），制成悬浮液，用以接斜面，并控制好斜面的涂布面积，使菌落分布均匀，密度适宜。划线后的接种针应做双碟划线培养或浸入肉汤做无菌检验。

（2）放线菌实验室阶段扩大培养

孢子制备是发酵生产的起始环节，孢子的质量、数量对后续工艺中的菌丝的生长、繁殖和发酵水平都有明显的影响。菌种不同，孢子的制备工艺不同。放线菌的孢子培养基多采用半合成培养基，培养基中含有适合孢子形成的营养成分，如麸皮、蛋白胨和无机盐。培养基中氮源不能太丰富，碳氮比应该大些，从而避免菌丝的大量形成，以产生大量孢子。其扩大培养工艺如下（包括生产车间种子扩大培养工艺）：冷冻管或沙士管斜面代斜面二代摇瓶种子罐发酵罐放线菌孢子的培养温度多为28℃，部分菌种为30℃或37℃，培养时间因菌种不同而异，般为4~7d，也有14d，甚至有些达到21d。孢子成熟后于5℃保存。存放时间不宜过长，般在周内，少数品种可存放30~90d。

制备放线菌孢子时，先要制备合格的琼脂斜面。琼脂斜面培养基灭菌后，冷却到40℃左右放置，温度不宜过高，否则冷凝水较多。待斜面凝固后恒温培养7~8d，经检查无杂菌后于4~6℃冰箱内保存备用，放置时间以不超过30d为宜。使用前在27~30C恒温箱中培养1d。操作时用灭菌冷却后的接种勺直接从沙土管内取适量沙土孢子（必须使用干接种法），然后均匀地散布在斜面培养基上，使长出的菌落密度分布均匀。沙土管用后可以立即冷藏保存备用，但是为杜绝杂菌污染，般应考虑废弃。

进行斜面传代，好不要超过三代，以防衰老和变异，必要时对斜面进行观察。斜面孢子移植时，好采用点种法。挑选形态正常的单个菌落，用接种针将孢子轻轻沾下，用划线法在斜面上划线，在斜面中下段形成单菌落，便于挑选传代的菌种。悬浮液接种要控制浓度，菌落不宜过密或过稀，过密容易把低单位或不正常的菌落掩盖，检查时难以发现；过稀则孢子数量太少，不宜用作种子。划线后的接种针均需浸入肉汤做无菌检查，培养2d观察是否污染杂菌。

（3）酵母菌实验室阶段扩大培养

酵母菌的种子扩大培养工艺（包括生产车间阶段）如下所示，般采用麦汁培养基进行扩大培养：试管斜面富氏瓶巴氏瓶卡氏罐汉生罐增殖罐发酵罐在有些工业化生产中，菌种生产厂把酵母菌制备为能长时间保存的固体菌种。生产厂把固体菌种以较大接种量接种于卡氏罐中，然后逐扩大培养。这样可以使菌种生产厂和产品生产厂各自充分发挥自身优势，提高产品质量，降低设备投入和生产成本等。有些厂甚至直接把大量的固体菌种在经增殖罐活化增殖后接入发酵罐，这样做可以减少工艺步骤，避免污染。

（4）霉菌扩大培养工艺

毒菌孢子培养大多采用大米、小米、麦麸等来源丰富、简单易得、价格低廉的天然培养基。天然培养基营养丰富，般比合成培养基产生孢子的数量多（不同来源的天然培养基，其成分可能相差较大，有时会对菌种扩大培养产生不利影响）。菌种扩大培养工艺（包括生产车间扩大培养工艺）为：沙士管或冷冻管或斜面母斜面子斜面摇瓶种子罐发酵罐先将保存的孢子接种在斜面进行培养，待孢子成熟后制孢子悬浮液，接种到大米或小米等培养基上，培养成熟成为“亲米"

由“亲米"再转到大米或小米培养基上，培养成熟成为“生产米"“生产米"接入种子罐。“亲米"和“生产米"的培养温度般为26~28℃，培养时间因菌种不同而异，般为4~14d。为了使通气均匀，菌体分散度大，局部营养供应均，在培养过程中要注意翻动或搅动培养基。制备好的大米或小米孢子，可放在5℃冰箱内保存备用，或将大米或小米孢子的水分去除到含水量在1%以下后保存备用。这种干燥孢子可在生产上连续使用180d左右。干燥孢子可以保存的时间较长，但是在整个孢子制备过程中要严格控制无杂菌污染，同时保存孢子的环境和设备要保证无杂菌污染的可能性。

制备孢子时要使母斜面生长的菌落尽可能分散，以便挑选理想的单个菌落。接种时应选取丰满的孢子，不要触及菌落边缘的菌丝。吸悬浮液时注意吸管上端塞的棉花要紧些，吸管下口要大些，吸管头不能接触火焰，否则孢子容易烫死或溢出口外，使用后的吸管随即插入肉汤内浸下做无菌检查。吸取孢子悬浮液体，也可以用移液枪（枪头先灭菌）在无菌环境下直接吸取，该方法方便、快捷。如果用带有过滤膜的移液枪，可以非常好地做到无杂菌污染。

孢子进罐的方式分为两种：直接进罐和经过摇瓶扩大培养后间接进罐。直接进罐的优点有：工艺路线较短，容易控制；斜面孢子易于保藏，菌种纯度高，次操作制备的孢子量较大。因此，直接进罐可节约人力、物力和时间，并减少染菌机会，为稳定生产提供有利条件。某些微生物菌种的孢子发芽和菌丝繁殖速度较缓慢，为了缩短种子培养周期和稳定种子质量，将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进罐。摇瓶的培养基配方和培养条件与种子罐近似。制备摇瓶种子的目的是使孢子发芽长成茁壮的菌丝，从而增加菌体的活力和菌体数量，同时可以先对斜面孢子的质量和无菌情况进行考察，然后选择质量较好的作为菌种保留。摇瓶种子进罐常用两培养的方式：母瓶培养和子瓶培养。母瓶培养基成分比较丰富，易于分解利用，氨源丰富利于菌丝生长。子瓶培养基更接近于种子罐的培养基组成。摇瓶种子进罐的缺点是工艺过程长，操作过程中染菌几率高。摇瓶种子的质量主要以外观颜色、菌丝浓度或黏度、效价以及糖氮代谢、ph值为指标，符合要求后方可进罐。