发酵培养基设计步骤

目前还不能从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某类菌的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

般培养基设计要经过以下几个步骤：

，根据前人的经验和培养要求，初步确定可能的培养基组分用量。

二，通过单因子实验终确定为适宜的培养基成分。

第三，当确定培养基成分后，再以统计学方法确定各成分适的浓度。常用的实验设计有均匀设计、正交试验设计、响应面分析等。

适培养基的配制除了要考虑到目标产物的产量外，还要考虑到培养基原料的转化率。发酵过程中的转化率包括理论转化率和实际转化率。理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算所得出的转化率的大小。实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小。实际转化率往往由于原料利用不、副产物形成等原因比理论转化率要低。

1.理论转化率的计算

生化反应的本质也是化学反应，理论转化率可以通过反应方程式的物料衡算来计算。但是，生化反应有其复杂性，要给出反应物和产物之间的定量的总代谢反应式，就需要对生物代谢过程的每步反应进行深入的研究，只有些代谢途径比较清楚的产物，可以对其理论转化率进行计算。

2.实验设计

由于发酵培养基成分众多，且各因素常存在交互作用，很难建立理论模型，培养基的成分和浓度都是通过实验获得的，因此培养基优化工作量大且复杂。般先是通过单因子实验确定培养基的组分，然后通过多因子实验确定培养基各组分及其适宜的浓度。目前许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如生物模型（biological mimicry）、单次试验（one at a time）、全因子法（ful factorial）、部分因子法（partial factorial）、plackettfBurman法等，但每种实验设计都有它的优点和缺点，不可能只用种试验设计来完成所有的工作。

（1）单次单因子试验

实验室常用的优化方法是单次单因子（one variable at a time）试验。这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过次改变个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期。因此，现在的培养基优化实验中般不采用或不单采用这种方法，而采用多因子试验。

（2）多因子试验

1）正交试验

正交试验设计是研究多因素多水平的种设计方法。它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散、齐整可比"的特点，通过合理的实验设计，可以较快地取得实验结果。具体可以分为下面四步：，根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；第二，根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；第三，根据正交表给出的实验方案，进行实验；第四，对实验结果进行分析，选出较优的“试验"条件以及对结果有显著影响的因子。正交试验设计可同时考虑几种因素，寻找佳因素水平结合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的个明确的函数表达式（即回归方程），从而无法找到整个区域上因素的佳组合和响应面值的优2）均匀设计

均匀设计是数学方开泰和元于1978年先提出来的。它是种只考虑试验点在试验范围内均匀散布的试验设计方法。由于均匀设计只考虑试验点的“均匀散布"，而不考虑“整齐可比"，因而可以大大减少实验次数。均匀设计按均匀设计表来安排试验，均匀设计表在使用时值得注意的是表中各列的因素水平不能像正交表那样任意改变次序，而只能按照原来的次序进行平滑，即把原来的后个水平与个水平衔接起来，组成个封闭圈，然后从任处开始定为个水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三个水平。均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀分布，因而可使所需试验次数大大减少。例如项5因素10水平的试验，若用正交设计需要做102次试验，而用均匀设计只需做10次，随着水平数的增多，均匀设计的优越性就愈加突出，这就大大减少了多因素多水平试验中的试验次数。

3）plackettlBurman法

plackett固Burman试验主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著影响的试验设计方法。此方法主要是对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，避免在后期的优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源。理论上，plackett留Burman设计法可以达到99个因子仅做100次试验，因此，它通常作为过程优化的初步实验，用于确定影响过程的重要因子。p.Castro报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把v干扰素的产量提高了45%。但该法的缺点是不能考察各因子的相互交互作用。

4）部分因子设计法

部分因子设计法与plackettlBurman设计法样是种两水平的实验优化方法，能够用比全因子法次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出次多项式，并以此利用陡爬坡法确定大响应区域，以便利用响应面法进步优化。

5）响应面分析法

响应面分析（response surface analysis，RSM）法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法样，由于采用了合理的实验设计，能以经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系。其他试验设计与优化方法未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其优化点，虽然能找出优值，但难以直观地判别优化区域。响应面分析法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的优化条件。近年来较多的报道都是用响应面分析法来优化发酵培养基，并取得比较好的成果。

RSM有许多方面的优点，但它仍有定的局限性。先，如果将因素水平选得太宽，或选的关键因素不全，将会导致响应面出现吊兜和鞍点。因此事先必须进行调研、查询和充分的论证，或者通过其他试验设计得出主要影响因子；其次，通过回归分析得到的结果只能对该类实验做估计；第三，当回归数据用于预测时，只能在因素所限的范围内进行预测。响应面拟合方程只在考察的紧接区域里才接近真实情形，在其他区域里拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。

中心组合设计是种际上较为常用的响应面法，是种五水平的实验设计法。采用该法能够在有限的实验次数下对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，而且还能对各因子进行优化，以获得影响过程的佳条件。