菌种的基因工程育种方法

要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，先必须选取性能优良的生产菌种。菌种选育包括根据菌种的自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法利用诱变育种技术、原生质体融合技术、基因工程技术而进行的诱变育种、细胞工程育种、基因工程育种等。

基因工程育种

20世纪70年代出现的基因工程技术给微生物育种带来了革命性的变化。基因工程育种是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的重要技术而发展起来的门新兴应用科学，是种自觉的、能像工程样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是新有前途的育种方法，所创造的新物种是自然演化中不可能发生的组合。因为基因工程的实施先需要对生物的基因结构、顺序和功能有充足的认识，而目前对基因的了解还十分有限，蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸及次代谢产物）的产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径没有被发现，所以就目前而言，基因工程的应用仍存在着很大的局限性，基因工程产品主要是些较短的多肽和小分子蛋白质。

基因工程育种的全部过程般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。近年来出现的运用基因工程定向育种的新技术主要有以下几种。

1.基因的定点突变

定点突变（sitellspecific mutagenesis 或sitelldirected mutagenesis）是指在目的DNA片断（如个基因）的位点引入特定的碱基对的技术，包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以pCR为基础的定点突变。pCR的定点突变技术由于具有突变效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点而备受关注。因此，近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术，如重叠延伸pCR法（overlap extension pCR，简称EOlpCR）、大引物pCR法（megaprimer pCR）、步重叠延伸pCR（onelstep overlap extension pCR，简称OOE图pCR）、单管大引物pCR（singlelltube megaprimer pCR）、快速定点诱变法、多位点环状诱变法和TAMS（targeted amplification of mutant strand）定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物pCR和TAMS定点诱变技术为简单和适用，并得到广泛的应用。

2.易错pCR DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以定的频率发生碱基错配，这现象恰好提供了种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用pCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错pCR（errorlprone pCR，简称Ep图pCR）。

利用Mn2+替代天然的辅助因子Mg2+，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTp的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1%。另外，还可以在该反应体系中加入dITp等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率提高至20%。从易错pCR的操作过程可以看到，此法与传统诱变育种技术之间的差别就在于，前者是基因水平上的随机突变操作，而后者则是细胞水平上的随机诱变技术。此外，易错pCR般只产生点突变，因此其产生的突变体在多样性方面尚有定缺陷。但作为种能够从单基因产生丰富的随机突变体的技术，易错pCR仍有广泛的应用域。

3.DAN重排

DNA重排（DNA shufling）技术是种利用重组文库的体外定向进化技术，是由Stemmer于1993年先提出的。DNA重排的基本原理是，先将同源基因（单基因的突变体或基因族）切成随机大小的DAN片段，然后进行pCR重聚，那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每轮循环中互为引物和模板，经过多次pCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。

DNA重排的大特点是在反复突变过程中引进了重组这自然进化中重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。由于可以产生丰富的重组突变体文库，因此该技术已经在许多域得到广泛应用，其中包括：改善生物分子的活性和稳定性，在非天然环境下改善蛋白质的活性和稳定性，开发酶抑制剂，提高抗生素抗菌活性或开发抗生素新功能，扩大酶作用的底物范围及改变底物特异性，发现新型疫苗和药物分子，提高抗体亲和力，以及开发新的代谢途径等。

4.基因组重排

基因组重排（genome shufling）技术是受DNA重排的启发，于21世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选出表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术（即将各种亲本制成原生质体-融合-再生，再制成原生质体-融合-再生…），即递归原生质体融合（recursive protoplast fusion）的方法。与DNA重排技术相比，该法的大特点是不必了解菌株的遗传背景，在细胞水平上即可进行定向进化。在人们对微生物的遗传特性尚未掌握的今天，利用基因组重排技术可快速实现基因的突变与筛选，其有可能成为现代工业微生物育种的种有效手段。