三磷酸腺苷的发酵生产工艺流程及操作步骤-核酸类药物发酵技术

、三磷酸腺苷的概述

1.三舜酸腺并的结构

三磷酸腺苷（ATP）是由1个腺嘌呤、1个核糖和3个磷酸单位组成的核苷酸，结构式如下：H，N O OHOH

2.三磷酸踩苷的理化性质

药用ATP是其二钠盐（ATP-Na?），又名腺苷三磷酸二钠，带3个结晶水（ATP-Na；·3H:O），呈白色结晶形及类白色粉末；无臭，微有酸味，有吸湿性；易溶于水，难溶于乙醇、、苯、，在碱性溶液（pH10）中较稳定。ATP-Na?为两性化合物。

3.三磷酸腺并的生理功能

三磷酸腺苷是体内组织细胞切生命活动所需能量的直接来源，被誉为细胞内能的“分子货币"，储存和传递化学能，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需要它参与，可促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性，对治疗各种疾病均有较强的针对性。

二、三磷酸腺苷的生产方法

ATP是重要的医药品，其生产方法可以腺嘌呤为前体用发酵法直接生产，也可以AMP为原料，经过磷酸化作用生成ATP。AMP可以腺嘌呤为前体发酵生产，也可先发酵生产腺苷，再经微生物磷酸化或化学方法磷酸化而创得。

1.AMP的生产

1）以腺嘌呤为前体发酵生产AMP产氨短杆菌ATCC6872等菌株可由嘌呤碱基生成相应的嘌呤核苷酸。例如由腺票呤生成AMP、ADP和ATP.在该发酵过程中，产氨短杆菌补效途径活性强和磷酸酯酶活性弱的特点有利于核苷酸的生成和积累。

2）以腺嘌呤为前体发酵生产腺苷

1962年，Nara等把枯草芽孢杆茵160（Sm2+try）菌株经再次诱变得到的嘌呤缺陷型（Sm'+try+pur）菌株，在添加由丙二胺化学合成的腺嘌呤的培养基中培养，从而累积大量的胀苷。培养基的碳源以葡萄糖为佳，若添加少量核糖可增加腺苷的产量。氮源以蛋白胨、肉膏、酪朊氨基酸为佳。添加能提高腺甘产量，培养基中添加1~2

mg/ml的腺嘌呤，培养40h，可积累1mg/mL腺苷。

3）直接发酵生产腺苷

生产原苷的出发菌株般选用具有强烈的降解核苷酸酶系的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌。理想菌种的特性如下：

①丧失IMP脱氛酶，即缺陷型。为了防止回复突变，将其进步再诱变成丧失XMP的氯化酶，即增加缺陷型的遗传标记是有效的。

②需要切断从AMP到IMP的通路，丧失AMP脱氨酶或该酶活性微弱。

③为了积累腺苷，凡属腺苷分解酶的核苷酶或核苷磷酸化酶的活性必须微弱。

④必须解除AMP类物质终产物反馈调节。可选育抗代谢类似物突变株，如8AG、8AX等，综上所述，枯草芽孢杆菌作为腺苷产生菌的遗传标记应具备：Xan+Gu+dea +8AG+Np。

2.微生物磷酸化

通过磷酸化作用可将、腺苷、鸟甘等核苷分别转变成IMP、AMP、GMP等，并将AMP转变为ADP、ATP，将GMP转变为GDP、GTP。

面包酵母和清酒酵母的酶制剂可使AMP磷酸化为ADP和ATP，并伴随有葡萄糖的降解。

使用磨碎的面包酵母或丙砌干燥的面包酵母菌体，在葡萄糖发酵条件下添加AMP或腺苷，进行氧化磷酸化。所加入的AMP或腺苷被高效地磷酸化为ATP和ADP。反应3h，可将约72%的AMP磷酸化为ATP。作为酶原，若使用风于菌体或活菌体，AMP的磷酸化几乎不能进行。自腺苷磷酸化生成ATP，只能使用丙酮干燥菌体。该方法的关键在于反应液中磷酸盐缓冲液的浓度。即在使用丙酮干燥菌体的场合下，磷酸盐缓冲液浓度为1/3mol/L时才能引起AMP的磷酸化；当磷酸盐缓冲液的浓度为1/9mol/L或2/3mol/L时，磷酸化反应不能发生。使用研碎菌体时，磷酸化的适磷酸盐冲液浓度为1/4mol/L。关于ATP的生成机制，可以认为是利用葡萄糖分解时获得的能量，通过底物水平磷酸化，由AMP或腺苷经ADP生成ATP。就发酵条件而言，以高浓度Pi抑制磷酸酯酶的作用和用AMP解除高磷酸盐浓度时的发酵障得是此方法的本质。

3.发酵法生产ATP

根据以腺嘌呤为前体发酵生产AMP的初步研究结果，进步改良发酵工艺，则有可能大生产ATP。

产氨短杆菌B1-787经菌种培养后移入发酵罐培养，在适当的培养基、温度、pH、通气及搅拌条件下培养40h，后加入前体物质腺嘌呤及表面活性剂和尿素，控制条件继续培养，使发酵结束时发醉液中含有较多的ATP。

发酵液经适当的预处理，过滤得到滤液，经活性炭柱吸附和氨醇溶液洗脱，获得ATP溶液。ATP的磷酸基在碱性氨醇中解离成阴离子，经阴离子交换柱吸附，用定离子强度的溶剂洗脱，收集得到ATP粗品，用结晶法获得ATP精品。

上述发酵方法以采用高浓度磷酸盐为特征，添加表面活性剂可以提高ATP产量。

此外，加入氨基酸、维生素等可促进营养缺陷型生产菌株的生长，防止发酵过程中回复突变的发生，有利于稳定发醉，提高ATP产量。

三、菌种培养

培养基成分：葡萄糖10%，MgSO，·7H?01%，尿素0.3%，CaCl?·2H2O0.01%，玉米浆适量，1%，磷酸二氢钾1%，pH为7.2.

各种子培养时间为0~24h，接种量为7%~9%，pH控制在6.8~7.2。

四、发酵培养

将菌种接种到发酵罐培养28~30℃，24h前通气量为0.5：1，24h后通气量为1.0：1，40h后投入腺嘌呤0.2%，6501（椰子油酰胺）0.15%，尿素0.3%，升温至37C，pH为7.0.

五、提取及精制

发酵液加热使酶失活后，调节pH至3~3.5；过滤除去菌体，滤液通过769型活性炭柱，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再经Cl-型阴离子柱，经氯化钠-盐酸溶液洗脱，洗脱液用结晶法制得ATP精品。

考思考题

1.核酸类药物主要有哪些临床应用？举例说明。

2.有何性质？目前发酵法生产主要有哪几种途径？

3.简述发酵生产的过程。

4.ATP的结构与性质是怎样的？

5.简述ATP发酵生产的过程。