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试剂及材料:
1)PBS
2)0.8%正常熔点凝胶(PBS配制)
3)0.6%低熔点凝胶(PBS配制)
4)毛玻璃片
5)盖玻片
6)碱性裂解液(2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠),临用前加10%DNMSO,1%Triton X-100
7)电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH;Tris.Cl,pH7.5)
8)EB(2ug/ml)
步骤:
1.制备*层胶:100ml 0.8%正常熔点胶,加盖盖玻片,4℃固化10min;
2.制备第二层胶:轻轻地去除盖玻片,在*层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6%低熔点胶(cell与凝胶比例为1:5),加盖盖玻片,4℃固化10min;
3.裂解:去掉盖玻片,将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内(临用前加10% DMAO,1%Triton X-100),4℃裂解1h;
4.取出玻片,用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内,加入pH13的电泳缓冲液(没过玻片2-3min),放置20min(黑闭)。
5.电泳:电压20V,300mA,30min
6.取出玻片,用PBS或Tris.Cl,pH7.5漂洗3次,每次3min;
7.染色:胶上滴加3ulEB,加盖盖玻片,24h检测。或者4℃,潮湿,闭光的条件下保有胶片,观察时再染色,镜检。
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