以生物素—亲合素反应为基础的放大系统

    生物素是维生素B复合物的水溶性成分之一，分子量244，可自卵黄提取或人工合成。生物素作为各种羧化酶的辅酶（又称为辅酶R或维生素H）参与各种羧化反应。

    亲合素是从卵清中提取的一种67kD糖蛋白，生物素又叫维生素H，几乎存在于所有细胞中，尽管含量较少。天然亲合素是由4个亚单位组成的碱性糖蛋白，分子量为66 000～68000D，等电点（p1）为10．5。亲合素活性单位的定义为：凡结合1ug生物素所需的亲合素的量为亲合素的一个活性单位。每毫克亲合素zui多能结合14／tg生物素，也就是说每毫克亲合素所能获得的zui高的特异活性为14 U。链霉菌亲生物素蛋白（streptavidin）的特性非常类似于亲合素，可取代亲合素用于涉及到生物素—亲合素系统的酶联免疫测定技术，而且非特异显色较使用生物素更低。

    生物素—亲合素系统之所以能成为免疫测定技术中的重要工具，主要是因为其有下述几个特点：①亲合素对生物素的亲和力*，亲和常数101‘／mol，为抗原抗体反应的百万倍，具高度特异性和稳定性。②生物素分子小，结构简单，极易与抗体、核酸、多糖及多种酶等生物大分子以共价键稳定结合，同时对结合物的原始生物活性无不良影响。③亲合素性质极为稳定，每分子可结合4个生物素衍生物，其作为生物素化的分子之间的桥接物，起放大作用。同时，它又是糖蛋白，可直接与各种生物分子如IgG及茶碱、苯妥英、蛋白质等耦联。

    由生物素—亲合素反应建立放大系统，一般有两种方法，其一是用生物奉标记抗体，与固相抗原结合后，再加入亲合素—酶结合物，从而使测定反应放大；其二是使用生物素—抗体、游离亲合素和生物素—酶结合物三种试剂，试剂加入顺序为生物素—抗体、亲合素和生物素—酶。该方法之所以可行，在于亲合素对生物素的四价结合能力，上述多步模式也可通过预先制成可溶的亲合素—生物素化酶复合物而得到简化，亦即所谓的ABC（avidin—biotin—complex）方法。但上述方法有时会见到较高的非特异背景显色，这通常是由于带阳电荷的亲合素分子（等电点为10）的非特异相互作用的结果，因此，目前常用与亲合素具同样结合特性的从链霉亲生物素蛋白（streptomyces avidinii）中提取的中性蛋白——链霉亲合素（streptavidin）来代替亲合素。普通的生物素—亲合素放大系统可使常规的EIA方法的测定敏感性提高2—100倍。

    Wilson等报道了一种生物素—链霉亲合素的新型EIA测定放大系统，称之为酶复合物放大（enzyme complex amplification，ECA）系统，其较常规的生物素—链霉亲合素系统的放大作用要高1～2个梯度，与RIA相似。ECA放大系统的关键是ECA试剂，该试剂是链霉亲合素、生物素—HRP和抗HRP-生物素的聚合体，可用来直接测定生物素化的抗原，或用于使用生物素化的抗体的ELISA中，亦可用于斑点免疫测定。ECA放大系统的优点是ECA试剂为预先制备，因此，操作中不增加EIA的测定步骤，此外，通过多层次ECA反应还可进一步增加测定的敏感性，缺点是对ECA试剂的制备要求较高；三种试剂之间的理想配比是成功地制备ECA试剂的关键。